Электронный научный журнал

Введение

Среди наиболее значимых геронтологических проблем в заболеваемости лиц мужского пола является такое состояние как гиперактивный мочевой пузырь (ГАМП). Появление ГАМП – большая проблема для лиц мужского пола, которая приводит к снижению социальной и ограничению физической активности с уменьшением продуктивности или полным отказом от работы, вынужденному ограничению сексуальных контактов, потере чувства собственного достоинства. ГАМП входит в группу так называемых «симптомов нижних мочевых путей» (СНМП), которые наблюдаются у 40% мужчин в возрасте старше 50 лет.

Риск возникновения синдрома гиперактивного мочевого пузыря увеличивается с возрастом, причем критическим является возраст старше 60 лет, где распространенность ГАМП максимальная. Увеличение риска появления ГАМП для мужчин объясняется не только возрастной дизъюнкцией мышц, но также гиперплазией предстательной железы, признаки которой в той или иной степени имеются примерно у 50% мужчин в возрасте 60 лет.

Несомненной для развития ГАМП у пожилых пациентов является роль сопутствующих заболеваний с нейрогенным и сосудистым компонентом, таких как сахарный диабет, цереброваскулярная патология, атеросклероз крупных сосудов, и другие, которые могут вызывать или усугублять нарушения сократимости детрузора. Особое место занимает системный атеросклероз, диагностирующийся у 50-70% случаев пожилых людей с ГАМП. Согласно данным многих источников как ГАМП сам по себе, так и ГАМП в сочетании с системным атеросклерозом является патологией, характерной для мужчин старше 60 лет, и не является возрастной нормой и характеристикой нормального старения. Поэтому наличие этих состояний свидетельствует о патологическом старении урогенитального тракта.

При анализе литературы нами было найдено минимальное количество работ по изучению биологических маркеров старения урогенитального тракта, которые могут использоваться для выявления процессов патологического и преждевременного старения этой системы. В литературе практически отсутствуют данные о закономерностях активации ваниллоидных и пуринергических рецепторов уротелия мочевого пузыря у мужчин пожилого и старческого возраста, о возрастных особенностях экспрессии сигнальных молекул уротелия мочевого пузыря у мужчин при его гиперфункции, системном атеросклерозе и их сочетании. Изучение модели патологического старения урогенитального тракта в виде развития ГАМП, являющегося клиническим аналогом гиперфункции уротелия, и системного атеросклероза представляется крайне актуальным в связи с высокой распространенностью данной сочетанной патологии.

Таким образом, в связи с вышеизложенным, высокую практическую значимость представляет поиск биологических маркеров патологического старения, а также возможность обобщить и систематизировать биологические маркеры патологического старения урогенитального тракта [1,2,3].

Цель исследования

Выявить биологические маркеры патологического старения урогенитального тракта на модели гиперфункции уротелия при системном атеросклерозе.

Материал и методы исследования

Характеристика пациентов, включенных в исследование. Все пациенты, включенные в исследование, были разделены на несколько групп в соответствии с критериями Всемирной организации здравоохранения по классификации возраста [World Health Organization. The world health report 2003: shaping the future. Geneva: World Health Organization, 2003; quity [web site]. Geneva, World Health Organization, 2009, http://www.who.int/healthsystems/topics/equity/en, accessed 28 June 2009]. В исследование было включено 278 человек: 93 мужчины среднего возраста, 92 мужчины пожилого возраста и 93 мужчины старческого возраста. Пациенты были разделены на следующие группы:

а) три группы мужчин в возрасте 53,6+2,7 года (средний возраст от 45 до 59 лет, n=31), 67,8+2,3 года (пожилой возраст от 60 до 74 лет, n=30), 84,2+1,9 года (старческий возраст от 75 до 89 лет, n=32) – без признаков гиперактивного мочевого пузыря и системного атеросклероза;

б) три группы мужчин в возрасте 54,7+2,3 года (средний возраст от 45 до 59 лет, n=30), 66,4+2,5 года (пожилой возраст от 60 до 74 лет, n=31), 85,7+1,1 года (старческий возраст от 75 до 89 лет, n=30) – с признаками гиперактивного мочевого пузыря без системного атеросклероза;

в) три группы мужчин в возрасте 55,9+2,6 года (средний возраст от 45 до 59 лет, n=32), 68,2+2,2 года (пожилой возраст от 60 до 74 лет, n=31), 86,3+1,6 года (старческий возраст от 75 до 89 лет, n=31) – с сочетанием гиперактивного мочевого пузыря и системного атеросклероза.

Диагноз ГАМП был выставлен в соответствии с рекомендациями Комитета по стандартизации терминологии Международного общества по удержанию мочи (ICS). Ведущей патологией у данных пациентов со стороны сердечно-сосудистой системы был системный атеросклероз (диагноз выставлен в соответствии с рекомендациями 42 сессии Всемирной организации здравоохранения - Всемирной ассамблеи здравоохранения, 42 сессия «Профилактика сердечно-сосудистых и других хронических неинфекционных болезней и борьба с ними» и Международной статистической классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем; 10-й пересмотр).

Дизайн исследования. Проведено поэтапное исследование. Общая схема исследования:

-  гистологическое исследование биоптатов уротелия

- изучение уровня экспрессии рецепторов уротелия к сигнальным молекулам (см. ниже).

Гистологическое исследование биоптатов уротелия.

После взятия биопсии биоптаты фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина в течение 24 часов. Далее образцы обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (70-95%), помещали в ксилол и заливали в жидкий парафин. Проводка осуществлялась с помощью станции Leica ТР 1020, с последующим изготовлением парафиновых блоков на автоматической станции заливки Leica EG 1160. При помощи микротома Rotary 3002 Pfm получали парафиновые срезы толщиной 3-5 мкм.

Для гистологического исследования биоптатов уротелия нами были использованы следующие методы окраски клеток.

1. Водный раствор азур-эозина по Романовскому-Гимза в разведении 1:5 наносили на препарат биоптатов уротелия и выдерживали 20 мин при комнатной температуре. Затем препарат промывали и заключали под покровное стекло.

2. 1% раствор орсеина наносили на препарат биоптатов уротелия и выдерживали 20 мин при комнатной температуре (работа с орсеиновым синим проводилась в вытяжном шкафу, т.к. в состав этого красителя входит уксусная кислота). Затем препарат промывали и заключали под покровное стекло.

3. 1% водный раствор метиленового синего наносили на препарат биоптата уротелия и выдерживали 50 мин при комнатной температуре, промывали и заключали под покровное стекло.

4. 1% раствор орсеина наносили на стекло на 5 мин, затем промывали дистиллированной водой и наносили 0,1% спиртовой раствор водного зеленого, далее вновь промывали водой и заключали под покровное стекло.

Иммуногистохимическое исследование

Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартной методике. Депарафинированные образцы биоптатов уротелия помещали на покрытые поли-L-лизином предметные стекла (Sigma). Для иммуноцитохимического исследования использовались первичные и вторичные антитела - моноклональные мышиные анти-человеческие антитела к различным сигнальным молекулам. Применяли антитела фирмы «Dako» к рецепторам ваниллоидных и пуриновых рецепторов, а также к рецепторам следующих сигнальных молекул:- ацетилхолину; - TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета – 1); - глутамату;- серотонину; - допамину (фирмы DLD, Германия).

Визуализацию иммуногистохимической реакции проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit), с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (Novocastra).

Морфометрическое исследование

Для оценки результатов иммуногистохимического окрашивания проводили морфометрическое исследование с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse E400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения Vidiotest Morphology 5.0». В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении 200.

Оптическую плотность экспрессии выявленных продуктов измеряли в условных единицах. Указанные параметры отражают интенсивность синтеза или накопления исследуемых сигнальных молекул.

Статистическая обработка материала

Статистическая обработка материалов исследования осуществлялась на персональном компьютере IBM PC (Intel Pentium-III), Windows Millenuim с помощью программных средств и пакета Statistica for Windows Version 6.0 (StatSoft Inc., США). Массив исходных данных был подготовлен так, что можно было сравнивать весь имеющийся набор сведений в анализируемых группах и подгруппах разного уровня. При соответствии нормальному закону распределения признака проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента с оценкой достоверности различий (p<0,05) по значениям M±m. Для оценки достоверности различий независимых выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, применяли непараметрический критерий Манна-Уитни, для зависимых выборок данных использовали критерий Вилкоксона. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05. При оценке связей качественных показателей применяли критерий достоверности связи Пирсона с поправкой Йетса, критерий Фишера.

Основные результаты исследования

Данные по изучению биологических особенностей экспрессии рецепторов уротелия к трансформирующему фактору роста бета – 1 в биоптатах  уротелия  у мужчин разного возраста представлены в таблице 1.

Таблица 1

Биологические особенности экспрессии рецепторов уротелия к трансформирующему фактору роста бета–1 у мужчин разного возраста

*p005, разность показателей между группами пациентов пожилого и среднего возраста;

**p0,5, разность показателей между группами пациентов старческого и пожилого возраста;

#p005, разность показателей между группами пациентов старческого и среднего возраста;

^оp,05, разность показателей между группами пациентов с ГАМП и без патологии;

^ооp,05, разность показателей между группами пациентов с ГАМП+атеросклероз и с ГАМП.

Возрастные биологические особенности экспрессии рецепторов уротелия к трансформирующему фактору роста бета–1 в биоптатах клеток уротелия заключались в том, что у здоровых людей с увеличением возраста не наблюдались изменения экспрессии рецепторов уротелия к трансформирующему фактору роста бета–1 (p>0,05). При ГАМП без системного атеросклероза и ГАМП с системным атеросклерозом наблюдалось достоверное увеличение экспрессии рецепторов уротелия к трансформирующему фактору роста бета–1 как с увеличением возраста (p<0,05), так и с нарастанием тяжести патологии (p0,05).

Данные по биологическим особенностям оптической плотности экспрессии рецепторов уротелия к ацетилхолину у мужчин разного возраста представлены в таблице 2.

Полученные данные свидетельствовали о том, что возрастные биологические особенности оптической плотности экспрессии рецепторов уротелия к ацетилхолину подчиняются тем же закономерностям, что и экспрессия рецепторов уротелия к трансформирующему фактору роста бета–1.

Таблица 2

Биологические особенности оптической плотности экспрессии рецепторов уротелия к ацетилхолину у мужчин разного возраста

*p005, разность показателей между группами пациентов пожилого и среднего возраста; **p0,05, разность показателей между группами пациентов старческого и пожилого возрас