Введение. Иммунная система осуществляет защитную функцию и участвует всохранении гомеостаза на органно - тканевом и молекулярно-клеточном уровне. В поддержании функциональной активности и взаимодействия иммунной системы с нервной и эндокринной системами участвуют сигнальные молекулы. Древнейшими в эволюции и одними из наиболее многофункциональных сигнальных молекул являются регуляторные пептиды. Так, нейропептиды VIP (vasoactive intestinal peptide) и CGRP (calcitonin gene related peptide) синтезируются в иммунных клетках, а с возрастом уровень их экспрессии снижается [1, 12].
Возрастная инволюция иммунной системы характеризуется снижением иммуногенеза в тимусе и селезенке, что приводит к развитию онкологической и аутоиммунной патологии. Основным проявлением старения селезенки является изменение миграции В-лимфоцитов, нарушение процессов клеточного обновления и синтеза ряда сигнальных молекул (опиоидные пептиды, пролактин, VIP, окситоцин, аргинин-вазопрессин, соматостатин, нейрофизин) [2].
Таким образом, в основе старения иммунной системы лежит снижение синтеза регуляторных пептидов и ослабление чувствительности к ним клеток-мишеней [11]. Нарушение пептидной регуляции снижает резистентность иммунных клеток к дестабилизирующим факторам внешней и внутренней среды и может являться одним из механизмов ускоренного старения и развития ряда заболеваний.
Установлено, что применение пептидных биорегуляторов (ПБ), разработанных в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии, позволяет восстановить функциональную активность иммунной системы при возрастной инволюции.
Применение ПБ тимогена (Glu-Trp) и дипептида АВ-0 (Lys-Glu) оказалось эффективным при ряде заболеваний, связанных со снижением клеточного иммунитета: при химиотерапии у онкологических больных, инфекционно-воспалительных заболеваниях и в постоперационном периоде [5]. Дипептид АВ-0 способен проникать в ядро и ядрышко клеток и связываться с ДНК и гистонами [6]. Молекулярный механизм иммунопротекторного действия ПБ связан с их способностью стимулировать пролиферацию и дифференцировку тимоцитов [3, 4, 9, 10].
Цель исследования: сравнительное изучение действия ПБ на экспрессиюсигнальных молекул в культурах клеток селезенки животных разного возраста.
Материал и методы. Селезенку молодых(3мес.)и старых(24мес.)крыс линииWistar разделяли на эксплантаты (фрагменты величиной около 1 мм3) и культивировали в чашках Петри в 3 мл питательной среды по описанной ранее методике [8]. Питательная среда включала в себя 35% среды Игла, 35% раствора Хенкса, 25% фетальной телячьей сыворотки, 0,6% глюкозы, 0,5 ед/мл инсулина и 100 ед/мл гентамицина. Эксплантаты селезенки в течение 3 сут культивировали в инкубаторе при температуре 36,7оС в условиях постоянного поступления 5% СО2. Культуры клеток селезенки были разделены на 4 группы: контрольную – с введением физиологического раствора и 3 экспериментальные – с добавлением пептидов АВ-0 (исследуемый пептид), Т-33 (отрицательный контроль) и тимоген (положительный контроль). Пептиды добавляли в культуры в следующих концентрации 0,05 нг/мл.
Для изучения экспрессии сигнальных молекул органотипические культуры фиксировали охлажденным до -20ºС 96% этиловым спиртом и проводили пермеабилизацию клеток 0,5% Triton X–100. Для иммуноцитохимического окрашивания клеток селезенки использовали первичные моноклональные антитела к Ki67 (Novocastra, 1:50), p53 (Novocastra, 1:50), CD5 (Dako, 1:50), CD20 (Dako, 1:50) и CD68 (Dako, 1:50). Для оценки результатов иммуноцитохимического окрашивания проводили морфометрическое исследование с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse E400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения «Vidеotest Morphology 5.2». Относительную площадь экспрессии рассчитывали, как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах.
Статистическую обработку результатов выполняли с помощью программы Statistiсa 7.0 с предварительной проверкой соответствия рассматриваемых переменных нормальному распределению по критерию Шапиро–Уилка. Для проверки статистической однородности нескольких выборок были использован непараметрический Н-критерий Крускала–Уоллиса.
Результаты исследования и их обсуждение. В культурах клеток селезенкимолодых крыс пептид АВ-0 повышал экспрессию маркеров CD20 и CD68 – площадь экспрессии возрастала соответственно на 21% и 35% (табл. 1). Тимоген способствовал увеличению площади экспрессии CD20 и CD68 в 1,6 раза. Пептид Т-33 в отличие от АВ-0 и тимогена не влиял на экспрессию маркеров иммунных клеток, что указывает на тканеспецифическое действие пептидов АВ-0 и тимогена.
В культуре клеток селезенки старых крыс пептид АВ-0 индуцировал увеличение экспрессии CD20 в 1,4 раза и CD68 в 1,7 раза по сравнению с контролем. Под действием тимогена площадь экспрессии Ki67 возрастала в 2 раза, CD20 – в 2,5 раза и CD68 – в 1,6 раза (табл. 2). Пептид Т-33 не влиял на синтез исследуемых маркеров иммунокомпетентных клеток. Таким образом, в культурах клеток, полученных от старых животных, тимоген и пептид АВ-0 стимулировали иммуногенез, а пептид Т-33, специфичный к нервной ткани, не обладал таким эффектом.
Заключение. Полученные данные свидетельствуют о выраженномтканеспецифическом действии ПБ на экспрессию сигнальных молекул в культурах клеток селезенки молодых и старых животных, что согласуется с полученными ране данными об иммунопротекторном действии коротких пептидов на тимус [7]. Пептиды АВ-0 и тимоген обладают стимулирующим эффектом в отношении иммунных клеток селезенки. Макрофаги селезенки осуществляют утилизацию эритроцитов, а В-лимфоциты участвуют в противоопухолевой и антивирусной защите организма.
Следовательно, пептидергическая активация данных субпопуляций иммунокомпетентных клеток при старении организма открывает новые пути к поддержанию иммуногенеза при возрастной патологии.
Список литературы.
- Кветной И.М. Структурно-функциональное сходство пинеалоцитов и клеток тимуса / И.М. Кветной, В.О. Полякова, Н.С. Линькова // Иммунология. - 2011. - Т. 32, № 3. - С. 131 -134.
- Кузнецова Е.П. Селезенка: онтогенез и старение / Е.П. Кузнецова, Н.С. Линькова, А.В. Дудков, М.А. Войцеховская // Геронтологический журнал им. В.Ф. Купревича. - 2011. - Т. 2, № 2. - С. 9 - 16.
- Хавинсон В.Х. Морфофункциональные основы пептидной регуляции старения / В.Х. Хавинсон, Н.С. Линькова, А.В. Трофимов [и др.]. // Успехи современной биологии. - 2011. - Т. 131, № 2. - С. 115 - 121.
- Хавинсон В.Х., Серый С.В., Малинин В.В. Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью // Патент РФ № 2080120. 1997.
- Anisimov V.N. Peptide bioregulation of aging: results and prospects / V.N. Anisimov, V.Kh. Khavinson // Biogerontology. - 2010. № 11. - P. 139 - 149.
- Fedoreyeva L.I. Interaction of Short Peptides with FITC-Labeled Wheat Histones and Their Complexes with Deoxyribooligonucleotides / L.I. Fedoreyeva, T.A. Smirnova, G.Ya. Kolomijtseva [et al.]. // Biochemistry. - 2013. - Vol. 78, № 2. - P. 166 - 175.
- Khavinson V.Kh. Tissue-Specific Effects of Peptides / V.Kh. Khavinson // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2001. - Vol. 132, № 2. - P. 807 - 808.
- Khavinson V.Kh. A Method of Creating a Cell Monolayer Based on Organotypic Culture for Screening of Physiologically Active Substances / V.Kh. Khavinson, N.S. Linkova, V.E. Pronyaeva [et al.]. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2012. - Vol. 153, № 5. - P. 795 - 799.
- Khavinson V.Kh. Peptides Regulate Cortical Thymocytes Differentiation, Proliferation, and Apoptosis / V.Kh. Khavinson, V.O. Polyakova, N.S. Linkova [et al.]. // Journal of Amino Acids. – 2011. - Vol. 2011. – Р. 1 - 5.
- Morozov V.G., Khavinson V.Kh. Thymus-gland preparation and method for producting same // United States Patent № 5, 070, 076. 1991.
- Straub R.H. The process of aging changes the interplay of the immune, endocrine and nervous systems / R.H. Straub, M. Cutolo, B. Zietz [et al.]. // Mech Ageing Dev. - 2001. - Vol. 122, № 14. - P. 1591 - 1611.
- Wimalawansa S.J. Age-related changes in tissue contents of immunoreactive calcitonin gene-related peptide / S.J. Wimalawansa // Aging. - 1992. - Vol. 4, № 3. - P. 211 - 217.