Введение. Одним из современных направлений клеточной геронтологии является исследование возможности применения стволовых клеток для восстановления тканей и органов. Наряду с эндогенным введением стволовых клеток, важным является подход, заключающийся в поиске веществ, активирующих собственные стволовые (полипотентные) клетки организма. Известно, что стволовые клетки способны давать начало клеткам гемопоэтического ряда, что было установлено при совместном культивировании эмбриональных клеток человека с линиями стромальных фибробластов, а также используя факторы роста гематопоэтических клеток [12, 13]. Помимо этого, в эмбриоидных тельцах были обнаружены популяции клеток, обладающие свойствами предшественников гематопоэтических и эндотелиальных клеток [7, 8]. Таким образом, СК способны дифференцироваться в направлении различных субпопуляций функционально активных клеток: кардиомиоцитов, нейронов, эндотелиоцитов капилляров. Оптимальный подбор условий направленной дифференцировки СК является важнейшей задачей современной молекулярной биологии и позволяет открыть перспективы применения СК в терапии важнейших возрастных заболеваний: болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, ишемической болезни сердца и сердечнососудистой патологии [4].
Одной из групп веществ, способных регулировать активность стволовых клеток, являются короткие пептиды. Природные пептиды постоянно синтезируются во всех живых организмах для регулирования физиологических процессов и передачи биологической информации и классифицируются в зависимости от характера действия и происхождения на 4 группы.
К первой группе относятся пептиды, обладающие гормональной активностью (окситоцин, вазопрессин, кортикотропин и др.). Вторая группа представлена пептидами, регулирующими пищеварительный процесс (гастрин, секретин и др.). Пептиды, источник которых – α2-глобулиновая фракция сыворотки крови (ангиотензин, брадикинин и каллидин), относят к третьей группе природных биорегуляторов. Четвертая группа представлена классом нейропептидов – макромолекул, синтезирующихся в центральной и периферической нервной системе и участвующих в процессах регуляции нервной деятельности (опиоиды, тахикинины, некоторые гипоталамические гормоны).
В последнее время большой интерес представляет изучение функциональной активности коротких регуляторных пептидов, происхождение которых было доказано А. Чихановецким, А. Гершко и И. Роузом после открытия убиквитин-опосредованной деградации белков в протеосомах. Они установили, что короткие пептиды играют важную роль в передаче биологической информации. Основным механизмом образования коротких пептидов является гидролиз высокомолекулярных белков, в результате которого образуются пептиды, имеющие различные биологические функции.
С. Карлином было показано, что макромолекулы белков в своем составе содержат несколько повторяющихся блоков аминокислотных остатков с заряженными боковыми группами. Наибольшее количество таких блоков содержится в ядерных белках: факторах транскрипции, белках центромеров и группе белков высокой подвижности. В результате протеосомного гидролиза этих макромолекул может образоваться достаточный набор пептидов с заряженными боковыми группами.
В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии были получены природные полипептидные экстракты, выделенные из органов крупного рогатого скота, и синтезированы их короткие аналоги, обладающие выраженной тканеспецифической активностью [1, 3]. Регуляторная активность природных и синтетических пептидов была изучена на клеточных культурах и в экспериментальных моделях на животных различного возраста [5, 6]. Установлено, что пептиды тканеспецифически стимулируют синтез белка в клетках тех органов, из которых они были выделены. Например, после введения обезьянам препарата эпиталамина и синтетического пептида эпиталона было отмечено увеличение секреции мелатонина [11].
На уровне организма у различных животных выявлено увеличение средней продолжительности жизни и усиление активности клеточного иммунитета. В частности, после введения мышам CBA пептидного препарата эпифиза максимальная продолжительность жизни животных возросла на 42,3%. Важно отметить, что максимальное увеличение средней продолжительности жизни было во многом обусловлено противоопухолевой активностью низкомолекулярных пептидов. Были получены экспериментальные данные, подтверждающие снижение в 1.4-7 раз частоты возникновения как спонтанных, так и индуцированных опухолей у животных [5, 6].
При исследовании биологического действия пептидных препаратов на уровне клеточных структур было установлено, что короткие пептиды способствуют трансформаци гетерохроматина в функционально активный эухроматин, усиливая транскрипцию генов [4, 9].
Кроме того, установлена способность пептидов индуцировать дифференцировку полипотентных клеток. При добавлении пептидов сетчатки к полипотентным клеткам ранней гаструлы лягушки Xenopus laevis привело к образованию клеток сетчатки и пигментного эпителия. На этой же экспериментальной модели было показано, что добавление других коротких пептидов приводит к образованию различных тканей, в зависимости от структуры добавляемого вещества [9]. Таким образом, система коротких пептидов является генетически детерминированной совокупностью сигнальных молекул, участвующих в регуляции гомеостаза.
В нашем исследовании были использованы короткие пептиды H-Glu-Asp-Arg-OH (пинеалон) и H-Lys-Glu-Asp-OH (везуген), полученные на основе анализа аминокислотных последовательностей природных полипептидных экстрактов, выделенных из органов крупного рогатого скота. В опытах на животных и клеточных культурах было установлено, что эти пептиды способствуют индукции синтеза регуляторных белков, влияют на пролиферацию и дифференцировку клеток, проявляют тканеспецифичность [2, 10, 11]. В частности, пептид H-Glu-Asp-Arg-OH способствует регенерации нейронов центральной нервной системы (ЦНС) за счет стимуляции синтеза тканеспецифических антиоксидантных белков, нормализации метаболизма и электрической активности нейронов. Пептид H-Lys-Glu-Asp-OH стимулирует пролиферацию клеток сосудов крыс в органотипической культуре. В связи с этим, целью нашего исследования явилось изучение влияния коротких синтетических пептидов на пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток человека (МСК).
Материалы и методы. Первым этапом эксперимента явилось исследованиевлияния трипептидов H-Glu-Asp-Arg-OH и H-Lys-Glu-Asp-OH на культуру МСК человека. На втором этапе был проведен конформационный анализ структур трипептидов методом конформационного поиска c использованием компьютерной программы Molecular Operating Environment 2012.10 для оценки влияния H-Glu-Asp-Arg-OH и H-Lys-Glu-Asp-OH на пролиферативный потенциал в зависимости от их структурных характеристик. Материалами для исследования явились препараты пептидов H-Glu-Asp-Arg-OH и H-Lys-Glu-Asp-OH, полученные в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии и культура МСК человека.
МСК выделяли из липоаспирата, полученного из абдоминальной жировой ткани человека. После выделения МСК из липоаспирата их культивировали в среде, содержащей 15% фетальной бычьей сыворотки, 82.5% DМЕМ, 1.5% НЕРЕS, L-глутамин и гентамицин, до 3 пассажа, после чего клетки 1 пассажа разделяли на 3 группы: 1 – контроль (введение физраствора), 2 – введение пептида H-Lys-Glu-Asp-OH и 3 – введение пептида H-Glu-Asp-Arg-OH и рассаживали в 24-луночный планшет. На 1, 3, 5 и 8 сутки клетки подсчитывали в камере Горяева.
Результаты и обсуждение. Под влиянием пептидаH-Lys-Glu-Asp-OHна3суткиколичество МСК возросло на 25% по отношению к контролю (рис. 1). При этом введение пептида H-Glu-Asp-Arg-OH в культуру МСК на 3 сутки приводило к снижению численности клеток на 65%. На 5 сутки полученный эффект был выражен еще более сильно. Так, под действием пептида H-Lys-Glu-Asp-OH численность МСК возросла в 2 раза по отношению к контролю и снижалась под влиянием пептида H-Glu-Asp-Arg-OH в 1,6 раза. К 8 суткам эффект пептида H-Lys-Glu-Asp-OH сохранялся, а действие пептида H-Glu-Asp-Arg-OH нивелировалось.
Таким образом, пептид H-Lys-Glu-Asp-OH стимулировал пролиферативную активность МСК, а пептид H-Glu-Asp-Arg-OH обладал ингибирующим действием.
Главные результаты конформационного анализа получены в силовом поле MMFF94. Расчеты проводили по стандартным схемам молекулярной механики, как с учетом, так и без учета наличия растворителя. Влияние растворителя учитывали в генерализованном борновском приближении с введением внутренней диэлектрической константы равной 1, а внешней 80. Предполагается, найденные конформации пептидов обладают наибольшей биологической активностью.
Молекула пептида H-Glu-Asp-Arg-OH состоит из двух отрицательно заряженных аминокислотных остатка - глутаминовой и аспарагиновой кислот, и положительно заряженного аргинина. Масса молекулы цвиттер-иона составила 417,4 Да, а суммарный заряд -1. Индекс гидрофобности по таблице Кайта-Дуллита оказался равным -11.5.
Пептид H-Glu-Asp-Arg-OH содержит 6 доноров и 8 акцепторов протона. Методом конформационного поиска было найдено 96 наиболее энергетически выгодных конформаций пептида. На рисунке 2 показаны первые 25 конформеров, совмещенных по пептидным связям. Энергия оптимизации конформеров отличалась на 4,6 ккал/моль, среднеквадратичное отклонение пространственных структур конформеров составило 0,356 Å.
Молекула пептида H-Lys-Glu-Asp-OH состоит из положительно заряженного лизина и двух отрицательно заряженных аминокислотных остатка глутаминовой и аспарагиновой кислот. Масса молекулы цвиттер-иона составила 389.38 Да, суммарный заряд -1. Индекс гидрофобности по таблице Кайта-Дуллита оказался выше, чем у пептида H-Glu-Asp-Arg-OH и составил -10.9.
Пептид H-Lys-Glu-Asp-OH содержит 4 доноров и 8 акцепторов протона. Были найдены 139 наиболее энергетически выгодных конформаций пептида. На рисунке 3 показано совмещение первых 25 полученных конформаций. Энергия оптимизации конформеров пептида H-Lys-Glu-Asp-OH отличалась на 3.7 ккал/моль, среднеквадратичное отклонение пространственных структур конформеров составило 0,143 Å.
Были рассчитаны наиболее энергетически выгодные конформации пептидов, которые они принимают в растворителе. При совмещении молекул было показано, что пептид H-Lys-Glu-Asp-OH является более стабильной молекулой, чем пептид H-Glu-Asp-Arg-OH.
Поскольку ранее было показано, что короткие пептиды влияют на пролиферативную активность и дифференцировку клеток через регуляцию экспрессии различных транскрипционных факторов, связываясь с промоторными зонами их генов, можно сделать следующее предположение [2]. Вероятно, трипептид H-Glu-Asp-Arg-OH, обладая рассчитанными характеристиками, образует стабильный комплекс с промоторной зоной одного из генов, ответственных за пролиферацию МСК, ингибируя его, тогда как трипептид H-Lys-Glu-Asp-OH обладает обратным действием.
Таким образом, короткие пептиды в зависимости от их структуры способны активировать пролиферацию МСК, способствуя поддержанию резервных возможностей организма, что особенно важно при ускоренном и естественном старении различных органов и тканей.
Список литературы.
- Хавинсон В.Х. Эпигенетические аспекты пептидной регуляции старения / В. Х. Хавинсон, А. Ю. Соловьёв, Д. В. Жилинский [и др.] // Успехи геронтологии. - 2012. - Т. 25, N 1. - С. 11-22.
- Хавинсон В.Х. Плавление двойной спирали ДНК при связывании с геропротекторным тетрапептидом / В.Х. Хавинсон, А.Ю. Соловьёв, Л.К. Шатаева // Биогеронтология. - 2008. - Т. 146, N 11. - C. 561-562.
- Хавинсон В.Х. Короткие пептиды, проникающие в клетку: модель взаимодействия с промоторными участками генов/ В.Х. Хавинсон, С.И. Тарновская, Н.С. Линькова [и др.] // Бюлл. эксп. биол. мед. – 2012, №10. - С. 391-396.
- Шумаков В.И. Первый опыт клинического применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для восстановления сократительной функции миокарда / В.И. Шумаков, Э.Н. Казаков, Н.А. Онищенко // Российский кардиологический журнал. - 2003. - N 5. - С. 232-238.
- Anisimov V.N., Khavinson V. Kh. Peptide regulation of aging // Biogerontology. - 2010.
- Anisimov V.N. Effect of synthetic themic and pineal peptides on biomarkers of ageing, survival and spontaneous tumour incidence in female CBA mice / V.N. Anisimov, V. Kh. Khavinson, A.I. Mikhalski, A.I. Yashin // Mech. Ageing Dev. - 2001. - Vol. 122, N 1. - P. 41-68.
- Dawn B. Bone marrow cells and regeneration / B. Dawn, R. Bolli // Basic Research in Cardiology. - 2005. - Vol. 100, N 6. - P. 494-501.
- Ferrari G. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors / G. Ferrari, G. Cusella-De Angelis, M. Coletta [et al.] // Science. - 1998. N 279. - P. 1528-1530.
- Khavinson V.Kh., Malinin V.V. Gerontological aspects of genome peptide regulation. Basel (Switzerland), 2005. – P.104.
- Khavinson V. Kh. Peptides Regulate Cortical Thymocytes Differentiation, Proliferation, and Apoptosis / V. Kh. Khavinson, V.O. Polyakova, N. S. Linkova, A.V. Dudkov, I.M. Kvetnoy // J. of Amino Acids. – 2011. - Article ID 517137. - doi:10.4061/2011/517137.
- Lin’kova N.S. Peptides from the Pituitary Gland and Cortex Stimulate Differentiation of Polypotent Embryonic Tissue / N.S. Lin’kova, A.V. Trofimov, A.V. Dudkov // // Bull. Exp. Biol. Med. - 2011. - Vol. 151, N.2. - P. 530-531
- Mihara K. Development and functional characterization of human bone marrow mesenchymal cells immortalized by enforced expression of telomerase // Hematol. - 2003. - Vol. 120, N 5 - P. 846-849.
- Vassilopoulos G. Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion / G. Vassilopoulos, P.R. Wang, D.W. Russell // Nature
. – 2003, N 422. - P. 901-904.